导读：对油菜花粉变应原进行了初步的分离、鉴定和纯化，为临床油菜花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。

变态反应性疾病(过敏性疾病)是临床上的常见病、多发病[1]，世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10%～30%。在众多的过敏原中，花粉是一种重要的过敏原，它可引起“花粉症”(枯草热)等疾病的发生及相应病症，如鼻粘膜、眼结膜和支气管炎症，甚至哮喘发作。

油菜具有种植面积广泛，花期长的特点，为春季主要花粉之一。我国南方种植的油菜是甘兰型油菜，90％属冬油菜，我国北部、西部和东北部，以及欧洲均以种植白菜型春油菜为主。国内谢水祥和曾继红等分别报道油菜花粉在全年花粉中分别占到了0.94%和1.8%[2-3]。Hemmer[4]等通过皮肤点刺实验和放射性过敏原吸收试验（RAST）进行为期1年的实验来评估对油菜花粉过敏的频率。发现对花粉过敏患者中有7.1%对油菜花粉过敏。国内未见甘兰型油菜花粉过敏原的有关报道，因此我们对我国南方种植的甘兰型油菜花粉进行分离纯化，并同时对油菜花粉变应原免疫学特性进行鉴定。

1材料与方法

1.1研究对象 油菜花粉采自南昌市郊；患者血清由南昌大学第一附属医院提供，其中混合血清来自于5个对油菜花粉过敏的患者。

1.2主要仪器和试剂 垂直电泳槽、转膜电泳槽、凝胶成像及分析系统；层析柱、快速蛋白液相层析系统(FPLC)。丙烯酰胺(Acr)(BBI)；十二烷基硫酸钠(SDS)(BIO-RAD)；预染蛋白Marker；生物素标记的IgE二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素(链霉亲和素)；硝酸纤维膜(NC膜)；DEAE-Cellulose（DE-52）。其余均为国产分析纯试剂。

1.3油菜花粉粗提液的提取 取油菜花粉于液氮中充分研磨，按1∶3的比例用丙酮4℃浸泡去脂至上清澄清。去丙酮，干燥后称重，以1∶20比例加入Coca’s液(氯化钠5g，碳酸氢钠2.75g，结晶酚4g，加蒸馏水至1000ml，pH8.2)，搅拌提取72h，10000r/min，离心10min，上清对蒸馏水透析[5]，以上均在4℃进行。

1.4油菜花粉粗提液进行SDS-PAGE 采用SDSPAGE体系分离粗提液中蛋白质组分并测定相对分子质量。分离胶12%、浓缩胶5%，考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相对分子质量。

1.5油菜花粉变应原的免疫学特性鉴定 采用Westernblotting方法对油菜花粉变应原进行免疫学特性鉴定，具体步骤如下：①用BIO-RAD转移槽将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上；②用TBS洗涤硝酸纤维膜2次，每次5min；③将膜用1％BSA封闭液封闭(4℃过夜)；④用含0.05％吐温-20的TBST洗膜3次，每次5min；⑤加过敏患者混合血清(用1％BSA-TBST进行1:9稀释)，37℃孵育2h；⑥同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的二抗-生物素，室温孵育2h；⑦同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的链酶亲和素-HRP，室温孵育2h；⑧同上洗膜5次，DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色，摄像后分析其相对分子质量。

1.6油菜花粉变应原的离子交换层析与鉴定 油菜花粉粗提液对0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)缓冲液透析24h后，进行DE-52离子交换层析。具体步骤如下：在FPLC层析控制系统下，用DE-52离子交换层析柱，以0.02mol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡，透析后花粉粗提液经0.45μm滤膜过滤后上样，待穿透峰后的基线走平后，改用洗脱缓冲液（0.5mol/LNaCl，0.02mol/LTris-HCl）进行线性离子梯度洗脱，流速2ml/min，时间80min，自动收集器收集各峰液。对样品进行SDS-PAGE及Westernblot－ting分析，确定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。